Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) è il principale agente causale del cancro batterico del ciliegio dolce. Rappresenta una delle maggiori criticità fitosanitarie per gli impianti di ciliegio a livello mondiale.
La gestione efficace della malattia richiede strumenti diagnostici capaci di quantificare con precisione l’inoculo batterico nei tessuti suscettibili durante le fasi fenologiche più delicate.
Un recente studio dal Cile ha validato un saggio di qPCR assoluta basato sul gene syrB, dimostrando come questa metodologia possa superare i limiti dei metodi colturali tradizionali e supportare strategie di difesa più mirate e sostenibili.
L’obiettivo dello studio è stato sviluppare e validare un protocollo di real-time PCR quantitativa per la determinazione assoluta di Pss in tre stadi fenologici chiave. I tre stadi considerati sono bottoni fiorali a cluster chiuso, cluster aperto e piena fioritura.
Il gene target scelto, syrB, codifica per una tossina lipopetidica (siringomicina) associata alla virulenza del patogeno, garantendo elevata specificità analitica. Nei tessuti di ciliegio sono presenti elevate concentrazioni di composti fenolici e polisaccaridi, noti inibitori della PCR.
Per ovviare a questo, il protocollo di estrazione del DNA con CTAB è stato modificato mediante l’aggiunta di PVPP (polivinilpolipirrolidone). Questo accorgimento ha consentito di ottenere curve standard lineari e amplificazioni specifiche, risultate assenti nei test preliminari privi di PVPP.
Le curve standard hanno mostrato un’eccellente linearità (R2 > 0,99) ed efficienze di amplificazione comprese tra 103,6% e 107,3%. Le variazioni intra- e inter-saggio sono risultate inferiori a 0,17 cicli Cq, a conferma di elevata riproducibilità.
I limiti di rilevazione (LOD) e quantificazione (LOQ) sono risultati adeguati per intercettare concentrazioni batteriche associate allo sviluppo del “flower blast”.
Queste condizioni si verificano soprattutto durante periodi umidi e freddi o eventi di gelo tardivo. Il confronto con il metodo convenzionale drop plate su terreno King’s B ha evidenziato differenze importanti. Mentre il 77,1% dei campioni mostrava colonie fluorescenti su piastra, solo il 18,8% risultava positivo alla qPCR specifica per Pss.
La correlazione tra i due metodi è risultata bassa ma significativa (ρ = 0,35), con differenze statisticamente significative. In particolare, allo stadio di open cluster la qPCR non ha rilevato campioni positivi. Probabilmente ciò è avvenuto a seguito di trattamenti battericidi effettuati il giorno precedente al campionamento. Il metodo colturale riportava invece cariche batteriche comprese tra 8,8×103 e 8,8×106 UFC per gemma.
Questa discrepanza evidenzia un limite strutturale dei metodi tradizionali, incapaci di distinguere tra ceppi patogeni e popolazioni fluorescenti non patogene. Oppure agenti di biocontrollo come P. protegens. La specificità del saggio è stata testata contro 23 ceppi batterici inclusi diversi Pseudomonas, Bacillus spp. e Xanthomonas arboricola pv. juglandis.
Non sono state osservate amplificazioni aspecifiche durante i test. Un’analisi in silico ha confermato l’elevata specificità dei primer per il complesso P. syringae. È stata tuttavia suggerita cautela in aree dove sia presente P. fragariae. Va inoltre considerato che la qPCR rileva DNA totale e non distingue cellule vitali da non vitali.
I ricercatori propongono quindi l’impiego di tecniche v-qPCR con PMA per discriminare le cellule metabolicamente attive. Operativamente, il saggio consente di processare fino a 300 campioni al giorno.
Si configura quindi come uno strumento ad alta capacità analitica per programmi di monitoraggio aziendale o territoriale. Le conclusioni evidenziano come la qPCR rappresenti un’alternativa più precisa rispetto alla drop plate. Questo è particolarmente rilevante per programmi di gestione integrata della malattia.
Il metodo permette di concentrare gli interventi contro Pss nei periodi di reale rischio epidemiologico. Ciò contribuisce a ridurre trattamenti non necessari nei frutteti. In un contesto di crescente attenzione alla sostenibilità e alla riduzione dell’utilizzo di fitofarmaci di sintesi.
L’integrazione di strumenti molecolari quantitativi può migliorare la precisione decisionale, ottimizzare la difesa e costituire una base per l’estensione della diagnostica molecolare ad altre specie di Pseudomonas associate al cancro del ciliegio.
Fonte: Lovera, Y., San Martin, J., Ruiz, B., Bastías, R. M., Gerding, M., Hirzel, J., & Moya-Elizondo, E. (2025). A qPCR assay for the detection and quantification of Pseudomonas syringae pv. syringae in susceptible tissues of sweet cherry. Journal of Microbiological Methods, 107351. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2025.107351
Fonte immagine: Bugiani, SFR RER
Andrea Giovannini
Dottore di Ricerca in Scienze e Tecnologie Agrarie, Ambientali e Alimentari - Arboricoltura Generale e Coltivazioni Arboree, Università di Bologna, IT
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