Il metodo LAMP per la rilevazione del cancro batterico del ciliegio

Il cancro batterico del ciliegio si è diffuso rapidamente in Cile nell'ultimo decennio. Questa malattia, già nota in diverse regioni del mondo dove si coltiva il ciliegio, è causata da un complesso batterico del genere Pseudomonas, che include principalmente Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) e Pseudomonas amygdali pv. morsprunorum (Pam).

Storicamente, Pss è stato il patogeno più frequentemente associato alla malattia nei frutteti commerciali cileni, ma nel 2021 è stato rilevato anche Pam, evidenziando la necessità di metodi altamente specifici per identificare e differenziare entrambe le specie. L'importanza di poter discriminare queste due specie batteriche deriva dalla possibilità di attuare programmi fitosanitari specifici, e dal fatto che le due specie presentano diversi comportamenti epidemiologici.

Data la maggiore prevalenza di Pss rispetto a Pam, è più probabile trovare ceppi del batterio Pss resistenti al rame rispetto alle popolazioni di Pam. Per identificare e differenziare queste specie, ricercatori guidati dal Dr. Nicola Fiore del Laboratorio di Fitovirologia dell'Università del Cile hanno sviluppato un nuovo metodo di rilevazione molecolare utilizzando le informazioni genomiche disponibili nella banca genetica e generate dal sequenziamento dei genomi dei ceppi batterici presenti in Cile.

La sensibilità e la specificità sono fondamentali per la rilevazione dei patogeni. La sensibilità si riferisce alla capacità della tecnica di rilevare il patogeno anche quando la sua concentrazione nel campione è bassa. La specificità si riferisce alla rilevazione esclusiva della specie batterica in esame, minimizzando i falsi positivi.

La PCR (Reazione a Catena della Polimerasi) è molto utile, ma richiede condizioni di amplificazione rigorose e apparecchiature, complicandone l'applicazione sul campo. La LAMP (amplificazione isotermica mediata da loop), basata sulla PCR, non richiede apparecchiature sofisticate o costose poiché la reazione di amplificazione avviene a temperatura costante.

Lo sviluppo di un nuovo metodo di identificazione come questo comporta diverse fasi, a partire dalla raccolta del patogeno isolato e di altre specie batteriche comuni nei ceraseti per valutare la specificità del metodo. Inizialmente, l'allestimento della LAMP è stato eseguito con Pam, utilizzando la PCR convenzionale come tecnica di confronto.

I batteri sono stati isolati da ciliegi sintomatici, che mostravano cancri, essudati di gomma, morte di ramoscelli, appassimento di fiori ecc. Questi isolati batterici sono stati identificati mediante studi basati sul sequenziamento ed il confronto di quattro geni. Una volta confermata l'identità degli isolati batterici, sono state cercate regioni uniche in ciascun genoma.

Per Pam, è stato identificato un gene collegato alla sintesi di proteine durante il processo infettivo. Basandosi sulla sequenza nucleotidica di questo gene, sono stati selezionati frammenti altamente conservati tra i ceppi di Pam come bersagli di amplificazione per le metodologie LAMP e PCR.

In termini di sensibilità, la LAMP ha rilevato quantità di DNA fino a 1 fg/μL, mentre la PCR ha rilevato fino a 10 pg/μL di DNA batterico, una quantità mille volte superiore rispetto alla LAMP, dimostrando l'alta sensibilità di quest'ultima.

In conclusione, la tecnica LAMP offre facilità di implementazione sia in laboratorio che sul campo (la presenza dei batteri nel tubo di reazione può essere rilevata anche visivamente mediante torbidità o cambiamenti di colore, usando un indicatore fluorescente). Questo rende LAMP un'alternativa efficiente alla PCR convenzionale, permettendo ai produttori di discriminare la specie legata al cancro batterico del ciliegio e reagire rapidamente e con protocolli specie-specifici.

Fonte: Díaz D. et al. (2024). Nuevo método para detectar bacterias asociadas al cáncer bacteriano. Revista Frutícola, 46, 1, (p.38-40), https://online.fliphtml5.com/zjsnx/nxbt/#p=41
Immagine: Fresh Quarterly

Andrea Giovannini
Università di Bologna (IT)

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