Le tecniche di coltivazione in vitro e crioconservazione sono strumenti fondamentali per la conservazione della biodiversità e la produzione di materiale vegetale sano, esente da patogeni. Tuttavia, l’impatto di queste tecniche sul microbioma associato alle piante è ancora non molto chiaro.
Un recente studio si è concentrato su questo aspetto, analizzando come la diversità dei batteri endofiti venga influenzata dalle procedure di coltura in vitro e congelamento criogenico nel ciliegio, e valutando se l’inoculo di specifici ceppi batterici possa migliorare la capacità rigenerativa delle piante dopo tali trattamenti.
Le cultivar di ciliegio dolce utilizzate sono state “Sunburst” e “Mindaugė”. I risultati mostrano differenze tra le due varietà in risposta al trattamento di congelamento criogenico: mentre “Sunburst” ha tratto beneficio dal pre-condizionamento, con tassi di sopravvivenza e rigenerazione che hanno raggiunto rispettivamente il 69% ed il 43%, “Mindaugė” ha mostrato risposte più deboli, con una rigenerazione limitata al 12% anche dopo il pretrattamento.
La parte principale dello studio riguarda l’analisi meta-tassonomica del microbioma batterico associato ai tessuti fogliari, alle gemme dormienti, ai germogli in vitro ed ai germogli post- crioconservazione. I risultati evidenziano una drastica riduzione della diversità microbica in condizioni in vitro, accompagnata dalla predominanza di una singola famiglia batterica, diversa a seconda del genotipo: Sphingomonadaceae per “Sunburst” e Mycobacteriaceae per “Mindaugė”.
Figura 1. Variazione della diversità batterica in campioni di foglie, gemme, controlli in vitro e germogli trattati con CF di ciliegio dolce. L'analisi di scaling multidimensionale non metrico (NMDS) dei dataset OTU generati utilizzando il sequenziamento metatassonomico della regione variabile V4 dell'rRNA 16S dei campioni di cv Sunburst e Mindaugė è stata effettuata utilizzando la matrice di dissimilarità di Bray-Curtis.
Dopo il trattamento criogenico, si sono osservate delle variazioni: nei tessuti di “Sunburst” risultavano dominanti i Burkholderiaceae, una famiglia di batteri nota per le sue interazioni positive con le piante e la capacità di resistere a condizioni estreme. Nei tessuti di “Mindaugė”, invece, i Mycobacteriaceae sono stati sostituiti dalle famiglie Bacillaceae ed Enterobacteriaceae, simili a quelle presenti nei tessuti fogliari delle piante in campo.
Lo studio ha anche testato la co-coltivazione: ai germogli crioconservati di “Mindaugė” sono stati applicati ceppi isolati di batteri promotori della crescita (Brevibacterium sp., Bacillus cereus e Bacillus toyonensis). I risultati sono stati interessanti: l’area fogliare è aumentata fino al 75% e la biomassa del germoglio del 37% rispetto al controllo non inoculato.
Figura 2. Abbondanza di taxa batterici endofitici in campioni di ciliegio dolce trattati con foglie, gemme dormienti, germogli in vitro e criocongelamento. I batteri endofiti la cui abbondanza non superava il 5% sono stati assegnati ad altri.
Questo dimostra che l’integrazione mirata di endofiti benefici può mitigare gli effetti negativi della crioconservazione e migliorare le performance della coltura in vitro. Inoltre, l’inoculo combinato dei quattro ceppi batterici non ha dato effetti additivi, suggerendo possibili interazioni antagonistiche tra i microrganismi.
Lo studio conferma che la composizione del microbioma endofitico è fortemente condizionata dalle tecniche di propagazione e conservazione, e che questa alterazione può influire negativamente sulla fisiologia della pianta, aumentando lo stress ossidativo e riducendo la crescita.
Al contrario, il ripristino controllato del microbioma può rappresentare una strategia efficace per sostenere la vitalità e la rigenerazione delle colture dopo crioconservazione.
In conclusione, lo studio mostra che la diversità dei batteri endofiti è significativamente ridotta in condizioni in vitro, portando spesso ad un aumento di un genotipo specifico e pertanto alla dominanza di batteri attribuiti ad un'unica famiglia.
Inoltre, gli esperimenti di co-coltivazione dei germogli con isolati batterici endofiti puri hanno dimostrato i benefici dell’applicazione di inoculi di batteri promotori della crescita per migliorare il recupero dei germogli dopo la crioconservazione.
Questi risultati mostrano nuove possibilità per migliorare la propagazione e la crioconservazione di piante clonali propagate utilizzando tecniche in vitro e congelamento criogenico.
Fonte: Vinskienė, J., Tamošiūnė, I., Rugienius, R., Andriūnaitė, E., Stanys, V., & Baniulis, D. (2024). Endophytic bacterial community dynamics in sweet cherry in vitro shoot culture and their role in shoot adaptation after cryopreservation. BMC Plant Biology, 24(1), 1145. https://doi.org/10.1186/s12870-024-05866-z
Fonte immagini: Vinskienė et al, 2024; VitroLeaf
Andrea Giovannini
Università di Bologna
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